Um três

npj Biofilmes e Microbiomas volume 9, Número do artigo: 57 (2023) Citar este artigo

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A infinidade de fatores de estresse que podem danificar as células microbianas desenvolveu mecanismos sofisticados de resposta ao estresse. Embora os biorepórteres existentes possam monitorar respostas individuais, ainda faltam sensores para detectar respostas multimodais ao estresse em microrganismos vivos. Proteínas fluorescentes vermelhas, verdes e azuis ortogonalmente detectáveis ​​combinadas em um único plasmídeo, denominado repórter RGB-S, permitem a análise simultânea, independente e em tempo real da resposta transcricional de Escherichia coli usando três promotores que relatam estresse fisiológico (PosmY para RpoS ), genotoxicidade (PsulA para SOS) e citotoxicidade (PgrpE para RpoH). O biorepórter é compatível com análise padrão e classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) combinada com análise subsequente do transcriptoma. Vários estressores, incluindo o 2-propanol biotecnologicamente relevante, ativam uma, duas ou todas as três respostas ao estresse, o que pode impactar significativamente as vias metabólicas não relacionadas ao estresse. Implementado em cultivo microfluídico com imagens de microscopia de fluorescência confocal, o repórter RGB-S permitiu a análise espaço-temporal de biofilmes vivos revelando subpopulações estratificadas de bactérias com respostas heterogêneas ao estresse.

A compreensão de como os microrganismos medeiam mudanças adaptativas para garantir a sobrevivência sob condições ambientais em mudança requer o monitoramento das correspondentes vias de resposta ao estresse. RpoS, SOS e RpoH são vias críticas de resposta ao estresse que modulam as vias transcricionais através de um amplo espectro de estímulos de estresse, com implicações na formação e proliferação de biofilme1,2, virulência de patógenos3, resistência a antibióticos4, evolução4 e competição ecológica5. O RpoS é um fator sigma alternativo que regula, direta e indiretamente, cerca de 500 genes em Escherichia coli (E. coli)6. Conhecida como resposta geral ao estresse, a ativação do RpoS é estimulada principalmente pela fome como um indicador de estresse fisiológico7. A resposta SOS, por outro lado, compreende mais de 50 genes que desempenham diversas funções em resposta a danos no DNA induzidos por agentes químicos, físicos ou biológicos8. Assim, a regulação positiva da resposta SOS está associada à genotoxicidade celular. O fator sigma alternativo RpoH é o principal regulador da resposta ao estresse por choque térmico em E. coli, que abrange mais de 30 genes9,10. A ativação da resposta RpoH é estimulada pelo acúmulo de proteínas desdobradas na célula como indicação de citotoxicidade.

Tendo em conta a elevada relevância destes processos biológicos para a tecnologia e a medicina, uma compreensão abrangente dos mecanismos moleculares subjacentes é de extrema importância. Por exemplo, o monitoramento das respostas celulares a múltiplos estressores pode dar uma contribuição importante para a compreensão da viabilidade e produtividade celular11, como inibição de produtos, privação de nutrientes, pH ou estresse de cisalhamento12, bem como para monitorar uma variedade de tóxicos ambientais, como herbicidas ou antibióticos13. Uma análise multimodal da resposta microbiana ao stress seria, portanto, importante não só para a investigação básica, mas também para os processos biotecnológicos.

Para atingir esse objetivo, vários biossensores bacterianos geneticamente codificados foram desenvolvidos . Os elementos repórteres comumente usados ​​são os repórteres colorimétricos de β-galactosidase (lacZ) e bioluminescência (luc, lux) . Como esses sistemas geralmente requerem lise celular, ensaios em múltiplas etapas ou reações catalíticas que limitam a medição on-line e relatórios multicoloridos, foram desenvolvidos repórteres baseados em fluorescência para a análise da resposta ao estresse . No entanto, os sistemas actualmente disponíveis não têm a capacidade de reportar a resposta multimodal de células vivas com elevada resolução espaço-temporal. Descrevemos aqui um biossensor fluorescente de três cores geneticamente codificado que exibe simultaneamente a resposta bacteriana ao estresse fisiológico, genotoxicidade e citotoxicidade através do monitoramento das vias de resposta ao estresse correspondentes (Fig. 1 e Fig. Complementar 1).